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广州市艾贝泰生物科技有限公司
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实验室仪器 / 设备、细胞库 / 细胞培养、耗材、技术服务
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公司新闻/正文
【重磅】电转染应用：从外泌体的巨胞饮途径到细胞内给药系统
1337 人阅读发布时间：2021-12-24 12:02
医麦客原文发布：
胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）如外泌体，是一类直径在30-200nm之间，具有磷脂双分子层的细胞分泌小泡。大多数细胞都可分泌EV。由于携带遗传物质（如microRNA）和种类丰富的酶，EV通常可参与细胞通信中免疫反应的调节，从而实现生物体的细胞调节作用。因其自身属性，包括：①参与细胞间通讯途径，②无细胞毒性，③可控免疫原性，④组成性分泌，⑤额外生物功能分子的包囊，⑥功能蛋白在膜中的表达等，EV还具有细胞内给药优势而备受期待，有望成为下一代细胞治疗的生物载体。
当大量的EV被分泌到体液中时（血液中外泌体的含量约为3×10^6个/μL），这常会导致细胞对EV的摄取竞争，除此之外，EV膜的负电荷也会拮抗它们在带负电的细胞膜上积聚。因此，为了实现有效的EV内容物的细胞内递送，特别是在胞质溶胶中，还需要一种完善的方法来提高EV的细胞摄取效率。
据报导，癌症相关受体（如表皮生长因子受体）的表达可诱导细胞的巨胞饮作用（伴有肌动蛋白重组、质膜皱折和大量细胞外液吞噬）并显著提高EV的细胞摄取效率。功能性活化修饰的EV本身诱导的巨胞饮作用对于基于EV的治疗分子的细胞内传递，已被强有力地证明是行之有效的。
近期，日本学者Ikuhiko Nakase及其研究团队利用八聚精氨酸肽修饰EV，卓有成效地诱导了细胞巨胞饮作用和其对EV的摄取作用。他们证实，这是一种具有代表性的富含精氨酸的细胞穿透肽（CPP），可被细胞有效内化。
然而，寡精氨酸肽序列中精氨酸残基的数量会影响其细胞摄取和细胞溶质的释放效率。在该研究中，该团队使用具有不同数量精氨酸残基的寡精氨酸肽序列修饰EV膜，并探究了其如何影响巨胞饮作用的诱导、细胞EV摄取和EV内容物的胞浆释放。
每个寡精氨酸肽具有不同数量的精氨酸残基（Rn:n=4,8,12,16），Rn-EMC（n-ε-马来酰氨基丙氧基丁二酰亚胺酯）是一种胺-巯基交联剂，寡精氨酸肽通过与Rn-EMC混合，可实现对EV膜的修饰。
如图1所示
这是寡精氨酸肽修饰EV的细胞摄取示意图。通过磺基EMCS连接物，EV可与寡精氨酸肽偶联。
如图2所示
这是在37°C下，在10%含血清的细胞培养基中培养24小时，Rn-EMCS修饰的CD63 GFP EV（20μg/mL）在CHO-K1细胞中的相对细胞摄取效率的流式细胞术分析图，该研究团队发现。寡精氨酸肽在EV膜上的结合显著增强了细胞对EV的摄取。而共轭寡精氨酸肽中的精氨酸储备数量更是直接影响细胞摄取效率。R8-EMCS或R12-EMCS的结合是所有寡精氨酸肽结合物中EV细胞摄取效率高的。由于R8-或R12-EMCS的修饰，细胞EV摄取量高出29倍。
如图3所示
这是在相同实验条件下，用Rn-EMC（n=8:20μM，n=16:10μM）修饰的FITC葡聚糖胶囊EVs（20μg/mL）处理CHO-K1细胞的共聚焦显微镜观察结果。该团队发现，木糖基转移酶是启动糖胺聚糖（GAG）合成所必需的酶，并且不产生可检测水平的蛋白多糖，在质膜上表达的蛋白多糖对细胞有效摄取寡精氨酸肽起着关键作用。
为了研究基于EV和细胞溶质释放的生物活性蛋白的递送，该研究团队通过电转染技术将核糖体失活蛋白saporin包囊在EV中，实验结果发现初封装在EV中的saporin的细胞摄取和胞浆释放增强是通过用R16-EMCS修饰EV膜实现的。并且每个寡精氨酸肽在细胞内呈现不同的胞浆释放效率，可能是由于R16的内质体膜扰动能力高于短寡精氨酸。
概而论之，该研究发现通过修饰EV膜上的寡精氨酸肽可有效诱导巨胞饮作用和细胞EV摄取。而使用带有EMCS连接物的寡精氨酸肽修饰EV膜，是一种无细胞毒性和简单可行有效方法，可为基于EV载体的细胞内给药系统提供新的研究思路。
我们发现，该研究团队在对EV进行药物加载的过程中，是通过电转染的方法来完成的。而转运加载的效率对下游实验的影响也至关重要。为了实现有效的EV包囊封装，研究者们选择了来自NEPA GENE的NEPA21高效基因转染系统，并终获得了成功理想的实验结果。
NEPA21 简介
1、采用独特设计的电转程序；电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式。
2、不需特殊转染试剂辅助，节省实验成本。
3、可应用于对细胞、组织和动物活体的转染。
4、电转参数实时可见、可调，适合对难转染细胞的条件优化。
常用配件
注：NEPA GENE共有250多种电极可选，用户可自由选配
参考资料：
1.Nakase, I., Noguchi, K., Fujii, I. & Futaki, S. Vectorization of biomacromolecules into cells using extracellular vesicles with enhanced internalization induced by macropinocytosis. Sci. Rep 6, 34937, doi:10.1038/srep34937 (2016).
2.Nakase, I. & Futaki, S. Combined treatment with a pH-sensitive fusogenic peptide and cationic lipids achieves enhanced cytosolic delivery of exosomes. Sci. Rep 5, 10112, doi:10.1038/srep10112 (2015).
3.Nakase, I., Kobayashi, N. B., Takatani-Nakase, T. & Yoshida, T. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Sci. Rep 5, 10300, doi:10.1038/ srep10300 (2015).
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