Nature子刊：基于油凝胶脂肪替代物构建可食用微载体衍生的微组织而开发的培养肉平台

细胞培养肉是指通过动物细胞体外培养生产的肉类产品，是近年来兴起的细胞生物学和组织工程等学科交叉的新领域。细胞培养肉的技术核心基于动物细胞的增殖能力，在体外大规模培养动物细胞获得肌肉、脂肪等组织，再经食品化加工生产得到肉类食品。细胞培养肉的开发旨在解决传统畜牧业空间和能源耗费巨大、不环保的弊端，降低对环境的影响，提高动物福利，并为世界日益增长的人口提供可用的蛋白质来源。国内部分政策中可以看出未来可能会有相关监管条例动向：2021年12月24日，农业农村部印发的《“十四五”全国农业农村科技发展规划》，也首次提到将细胞培养肉纳入到下一个五年规划当中；2022年5月10日，国家发改委发布《“十四五”生物经济发展规划》中提出的发展合成生物学技术，探索研发“人造蛋白”等新型食品，实现食品工业迭代升级，降低传统养殖业带来的环境资源压力。

2023年5月23日，以色列理工学院研究人员在期刊Nature Communications（IF: 17.694）发表了题为“Cultured meat platform developed through the structuring of edible microcarrier-derived microtissues with oleogel-based fat substitute”的研究论文。本研究证明了利用Applikon MiniBio生物反应器在可食用微载体上生产细胞微组织，经过聚集或均质加工生成的细胞块，被进一步嵌入油凝胶脂肪替代物，产生培养肉（CM）原型。

动物源性肉类中的脂肪成分对肉制品的味道、口感和质地有很大作用，为了模拟CM中脂肪的这些特性，专家学者开发开发了一种脂肪替代物（FS），利用植物油和凝胶剂制备固体结构化的油凝胶来替代肉制品中的动物脂肪。对于基于油凝胶的FS生产，这里使用基于油凝胶的水包油乳液模板的方法。生产基于油凝胶的基质的第一步是产生由蛋白质稳定的水包油凝胶乳液，油凝胶液滴致密且紧密堆积，平均尺寸为1-3μm，用单硬脂酸甘油酯（GMS）构建油滴颗粒，然后进行冻干（图5a）。

研究人员展示了一种开发CM产品的新方法，由可食用微载体和油凝胶脂肪替代物组成的CM平台（图1）。优化了牛骨髓间充质干细胞在可食用壳聚糖-胶原微载体上的扩增，获得细胞微组织；同时，开发了一种含有植物蛋白的油凝胶系统作为脂肪替代物，其外观和质地可与牛肉脂肪相媲美。研究者们结合细胞化微组织和开发的脂肪替代物，介绍了两种类型的培养肉原型：分层式培养肉和汉堡式培养肉。分层的原型有利于增强硬度，而汉堡样的原型具有大理石花纹肉样的外观和柔软的质地。总体而言，该平台及其建立的技术基础有助于不同培养肉产品的开发，并促进其商品化生产。

图1 培养肉平台示意图
 

牛原代间充质干细胞bMSCs在可食用微载体上的扩增培养

（1）细胞接种。可食用微载体以每cm²表面积8000-10000个细胞的密度接种，37℃培养。孵育24 h后，用FDA（活细胞）和PI（死细胞）染色种子微载体，荧光显微镜观察附着细胞及其在微载体上的均匀分布。

（2）细胞扩增。使用Applikon MiniBio生物反应器（500mL）进行动态培养。将种子细胞微载体与200mL培养基转移到生物反应器中，温度37℃，pH 7.2，DO 100%，进气速度1mL/min泵入空气，为整个培养体系提供气源。软件自动调节生物反应器的温度、pH和DO等参数，使其在整个培养过程中处于设定值。

为实现bMSCs在生物反应器中的规模化扩增，优化了以下条件：通气方式、搅拌速度和补料策略（图2）：

a．通气方式：

底部通气效果不佳，会产生泡沫，扰乱了微载体的正常悬浮状态。而顶通方式泵入空气，气体覆盖反应器罐体顶部空间，促进氧气扩散到培养基中而没有任何负面影响，因此选用顶通进行下一步（图2a）。

b．搅拌速度：

比较了搅拌速度从45rpm逐渐增加到70rpm和从60rpm逐渐增加至80rpm两种方案（图2b）。较低的搅拌速度虽然可以使细胞获得充足的营养和通气，但从细胞活力来看（图2c），它未能充分悬浮微载体，会积聚在罐底并形成聚集体（图2d）。较高的搅拌速度可以充分悬浮微载体，同时支撑细胞生长（图2a，b）。

c．补料策略：

优化了新鲜培养基添加时间，在培养第3、5和7天更换50%的培养基可以使细胞获得充足的营养，并及时降低代谢废物浓度。

图2 生物反应器培养参数的优化。（a）生物反应器通气方式的优化；（b）生物反应器搅拌速度的优化；（c）使用45rpm至70rpm搅拌速度时，微载体上活/死细胞的成像。绿色：活细胞；红色：死亡细胞。比例：100μm；（d）以45rpm至70rpm的搅拌速度培养时，生物反应器底部形成的聚集体（箭头）。
 

使用优化后的参数在生物反应器中动态培养，细胞更均匀。培养8天后收获细胞微载体，免疫荧光染色研究bMSCs表面标志物的表达，其特异性表面标记物对CD29和CD44呈阳性，对CD45呈阴性，为进一步验证这些结果，使用流式细胞术得到了相同的免疫表型（图3）。特异的bMSC表面标志物在扩增后仍保持不变，表明基于微载体的扩增培养没有诱导干细胞发生变化。

图3 bMSC在生物反应器中扩增8天后的免疫表型特征
 

采用先进的加工方法，以产生的微组织衍生聚集体（图4）、油凝胶脂肪替代物（图5）和转谷氨酰胺酶（TG）交联为基础，进一步整合构建出两种CM原型（图6a）。此外，研究显示，在生物反应器中培养时，bMSCs可成功地粘附在可食用的壳聚糖-胶原微载体上并增殖，且生长动力学曲线与实验室规模的培养相当，为未来大规模工业化生产提供了可行性的证明。

Applikon MiniBio生物反应器可用于干细胞扩增，并能够将剪切力和传质系数转化为工业规模生物反应器。一般来说，生物反应器中的动态搅拌有助于氧气和营养物质的均匀分布并混合，从而适合更大的容器和均匀的条件。对于工业规模化生产来说，整个培养的同质性对于保证产品的可复制性和标准化具有重要意义。从研究结果中也可以看出，在扩增8天后微载体上的细胞得到高效的增殖意味着其规模化商业生产的可行性。

图4 微组织衍生的聚集体
 

图5 脂肪替代物的生产和表征
 

图6 培养肉模型的结构和特征

近些年，头部细胞培养肉公司的投入重点已逐渐从实验室走向规模化，目前中国市场也有部分企业在培养肉领域获得了一些关键性技术突破，其中中试规模工厂从数量及产能上均有扩张趋势。细胞培养工艺过程的精准优化、高效放大等，是细胞培养肉规模化生产的核心技术，使用精准的小型生物反应器系统有助于早期工艺开发阶段进行筛选、优化培养基、建模等相关研究。小型反应器具有操作简单、通量高、成本低等优势，能够较大程度提升工艺开发的效率，降低研发成本和缩短开发周期。

Applikon MiniBio生物反应器

 参考文献 

◀ 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-38593-4

◀ Yen FC, Glusac J, Levi S, Zernov A, Baruch L, Davidovich-Pinhas M, Fishman A, Machluf M. Cultured meat platform developed through the structuring of edible microcarrier-derived microtissues with oleogel-based fat substitute. Nat Commun. 2023 May 23;14(1):2942. doi: 10.1038/s41467-023-38593-4. PMID: 37221160; PMCID: PMC10205709.

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