CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化

引入额外的正电荷，使等电点增加，形成原因如下：

• C末端赖氨酸不完全切除

• 脯氨酸酰胺化

• 氨基酸氧化

• 琥珀酰亚胺形成

单克隆抗体的电荷异质性还可能受一些胞外因素影响，细胞培养介质、细胞死亡后释放出的胞内酶、纯化以及储存过程的温度和pＨ等条件均可能导致电荷变体的产生。

例如，产生酸性电荷变体的一种机制是形成各种类型的共价加成物，如果制剂中存在还原糖，则其中的葡萄糖或乳糖可以在制备过程或在储存期间（在富含葡萄糖的培养基中）与赖氨酸残基发生伯胺反应。

单抗碱性变体形成原因

CHO细胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体的表达量。在验证此结果的基础上,分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,发现尿苷的加入并未改善抗体碱性电荷变体含量极高的问题。为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨酸变体含量大幅减少,但抗体Fab(Fragment of antigen binding,Fab)区甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。通过过氧化氢和AAPH(2,2’-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育实验证实,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗体碱性电荷变体形成的重要因素。

尿苷对细胞生长表达和抗体电荷异质性影响

尿苷添加使抗体碱性电荷变体组成发生改变，添加尿苷后赖氨酸变体含量降低，其余碱性电荷变体（非赖氨酸变体）含量升高。

添加尿苷的抗体碱性电荷变体主要由Fab区域的碱性电荷变体构成，Fab区甲硫氨酸和色氨酸氧化是碱性电荷变体的重要组成，其中重链Met34、轻链Trp90、轻链Met32氧化比例较高。

在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂，发现牛磺酸不仅使抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等质量属性影响较小。牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。胞内活性氧水平和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。